Terapia com Ondas de Choque Melhora a Disfunção Erétil de Ratos com Lesão Nervosa Pélvica

 

Huixi Li, Melanie P. Matheu, Fionna Sun, Lin Wang, Melissa T. Sanford, Hongxiu Ning, Lia Banie, Yung-chin Lee, Zhongcheng Xin, Yinglu Guo, Guiting Lin, Tom F. Lue

 

Introdução

Disfunção erétil relacionada com o trauma ocorre comumente em cirurgias pélvicas ou como resultado de lesões locais, tais como dispositivo explosivo improvisado no campo de batalha, e é mais frequentemente associada com o dano dos nervos cavernosos (CN) e / ou feixe do nervo pudendo interno  (IPB) . Após a lesão, isquemia e degeneração neural vantagem para ambos capacidade prejudicada erétil e sua falta de resposta aos tratamentos atuais incluem therapy.3 inibidores da fosfodiesterase V orais, dispositivos da ereção do vácuo, injeção peniana, terapia transuretral, e peniana prótese, mas nenhum deles pode restaurar physiology.4 erétil normal Além disso, falta-nos um bom modelo animal para estudar ED neurovascular. Consequentemente, os pesquisadores básicas e translacionais continuam a procurar strategies.5 eficaz

Ondas de choque de baixa energia (LESW) têm sido usados há anos para tratar mol ‘rstias musculoesquelética. Recentemente, a aplicação desta terapêutica foi expandido para lidar com doença isquêmica do coração e ED vasculogenica, mas há poucos relatos sobre as ondas de choque em efeitos sobre fibras nervosas ou neurovasculares. Em 2001, Ohtori et al relataram LESW estimulado reinervação de fibras sensoriais, e em 2006 outro grupo japonês descobriu que as ondas de choque induziam a expressão do associada ao crescimento proteína-43 (GAP-43, um marcador de cones de crescimento axonal) em ratos dorsal gânglios da raiz (DRG). As ondas de choque também foram relatados como indutores de células DRG para expressar factor de activação de transcrição 3 (ATF3), que promove o crescimento de neurites a partir de gânglios periféricos, quando o axónio é afetado.10 Além disso, já relatado que LESW melhora ED em diabéticos, promovendo a regeneração do nervo, um achado confirmado por outro group.12 Clinicamente, a terapia LESW também tem sido provado ser um potencial tratamento para a angiogênese e peniana rehabilitação.

Recuperação de DE neurovascular é uma tarefa difícil que envolvem o sistema vascular e do sistema nervoso periférico, enquanto a regeneração de nervos periféricos após a lesão pélvica é um processo complexo relacionado com os neurónios, as células de Schwann, lâmina basal, e a capacidade de resposta de órgãos terminais. Entre a orquestração destas várias células, as células de Schwann são frequentemente os primeiros “respondedores” neste microenvironment15 e desempenham um papel importante guiamento , que pode ser promovido por force células de Schwann mecânicas desempenhar um papel importante na regeneração axonal após a lesão, incluindo NC lesão que conduz a ED. No sistema nervoso peniana, as células de Schwann foram encontrados para ser funcional em feixes de fibras de Remak / C (composto principalmente no nervo cavernoso) e fibras A-δ (principalmente composta no nervo pudendo interno) .15, 19 No entanto, os efeitos de células de Schwann durante a regeneração do nervo do pênis não foram bem elucidados embora evidências indiretas afirma que os tratamentos com o objetivo de promover o crescimento de células de Schwann resultar em melhor recuperação da função erétil.

No estudo atual, foi desenvolvido um novo modelo ED rato de lesão neurovascular pélvica (PVNI) por lesão do nervo cavernoso bilateral e lesão do feixe pudendo interno, e testou o efeito do tratamento LESW em diferentes níveis de energia. Nossa hipótese é que LESW pode melhorar a função, angiogênese e inervações ativando as células de Schwann locais e aumentar o recrutamento de células progenitoras.

 

MATERIAIS E MÉTODOS

32 ratos machos recém-nascido Sprague-Dawley foram usados para este estudo. Cada um recebeu uma injecção intraperitoneal de 5-etinil-2 ‘-desoxiuridina. Ao fim de 12 semanas de idade, foram agrupados em 4 grupos (N = 8 cada): cirurgia simulada (placebo), lesão neurovascular pélvica por lesão do nervo cavernoso bilateral e lesão pacote pudendo interno (PVNI). Os PVNI receberam ondas de choque (LESW) com menos energia em baixa (Baixo), e outro grupo de PVNI receberam ondas de choque (LESW) de alta energia. Após 4 semanas de tratamento LESW e 1 semana de washout, todos os ratos foram submetidos a medição da função erétil. Os ratos foram então sacrificados e o pênis, gânglio pélvico e uretra foram submetidos a exame histológico. Estudos in vitro foram conduzidos utilizando cultura de células de Schwann destes ratos. Foram extraídos nervos ciáticos para cultura de tecido e receberam também aplicação de ondas de choque.

A lesão do nervo cavernoso bilateral (CNI) foi realizada como descrito anteriormente, 24 ao passo que a lesão IPB (IPB) foi conduzido como se segue: o rato foi posicionado em litotomia e uma incisão perineal horizontal foi feita. O IPB foi identificada entre o músculo isquiocavernoso (ICM) e o músculo bulbospongiosus (BCM). Sutura de ligação foi realizada bilateralmente. A cirurgia simulada foi realizada exatamente como o procedimento descrito, mas o nervo não foi seccionado.

Para o experimento in vivo, terapia LESW foi iniciada 48 horas após a cirurgia. Onda de choque foi aplicada à região pélvica com um sonda de ondas de choque concentrado (DermaGold, MTS Europe GmbH, Konstanz, Alemanha). Sob anestesia, cada rato foi colocado em decúbito dorsal com o seu abdômen inferior raspado e a pele do prepúcio reduzida. No grupo de baixa energia, 0,06 mJ / mm2, 300 pulsos em 3 Hz foi aplicada, enquanto que 0,09 mJ / mm2 foi aplicado no grupo de alta energia.

Para o estudo in vitro, as culturas de células foram usadas para o tratamento LESW. As células de Schwann receberam tratamento LESW (0,02 mJ / mm2, 200 pulsos em 3 Hz) depois de atingir 70% de confluência. A sonda foi tratada sob o prato de cultura de células com gel de ultra-som comercial padrão aplicado entre prato e sonda. As células foram tratadas uma vez e, em seguida, colhidas ou verificado em pontos de tempo correspondentes.

Um teste de pressão intracavernosa (PIC) foi usada para avaliar a função erétil. Os ratos foram anestesiados, realizada uma laparotomia na linha média e o corpo cavernoso foi canulado, heparinizado e ligado a um transdutor de pressão. O aumento máximo da curva de PIC de 3 estímulos foi seleccionado para a análise estatística, em cada animal. Imunofluorescência (IF) de coloração de tecido de rato foi realizada. As células de Schwann foram cultivadas em lamelas colocadas em placas de 6 ilhas. As secções de tecido foram incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C.

As lâminas coradas foram examinadas com um microscópio de fluorescência (Nikon, Eclipse, 80i). A análise das imagens foi realizada através do cálculo da densitometria computadorizada ou número de alvos positivos. As seguintes variáveis foram analisadas: número de vasos sanguíneos e feixes nervosos na seção dorsal do pênis, número de células positivas Edu na seção cavernoso do pênis, e número de núcleos de células de Schwann. A quantidade de factor de von Willebrand (vWF), óxido nítrico sintase neuronal (iNOS), S100, neurofilamento (NF), e-Erk1 p / 2 foi analisado com 5,1 programa Image-Plus (Media Cybernetics, Bethesda, MD, EUA) com base na densidade óptica integrada da área coradas positivamente em campos de alta potência em 4 grupos. Todos os dados foram calculados de forma cega.

O número médio de vasos sanguíneos e feixes de nervos dentro da zona dorsal do pênis foram contados e calculada (n = 8 para cada grupo).

O isolamento de proteínas e Western blot foram realizados. Após a incubação do anticorpo secundário, as imagens resultantes foram analisados para determinar o valor de densidade integrada de cada banda de proteína.

Para a análise do ciclo celular, 104 células foram recolhidas para cada ensaio. Sincronização do ciclo celular foi induzida por privação de soro. As células foram submetidos então a aplicação de ondas de choque (LESW) ou tratamento simulado. O ciclo celular foi verificada no ponto de tempo 0,8,16 e 24 horas após o tratamento LESW por citometria de fluxo e os resultados foram analisados.

Análise estatística: os resultados foram analisados utilizando software Prism 5). Vários grupos foram comparadas pelo teste t (2 variáveis) ou análise 1 de variância seguida pelo teste de Tukey-Kramer para comparações post-hoc (4 variáveis). A significância estatística foi fixado em P <0,05.

 

Resultados

O tratamento com ondas de choque de baixa energia melhora a função erétil. A recuperação da função erétil foi evidente no grupo que recebeu as ondas de choque, comparado com o grupo simulado (placebo). Para avaliar a recuperação da função erétil, foi analisada a relação da variação máxima do PIC ao MAP (PIC/ MAP). Ambos os grupos tratados mostraram um aumento significativo na PIC / MAP em comparação com o grupo de controle (0,56 ± 0,10 e 0,82 ± 0,08 vs 0,17 ± 0,03, P <0,05). As medidas sugerem recuperação parcial da função eréctil em ambos os grupos tratados (alta e baixa energia), mas ratos do grupo de alta energia demonstraram uma melhor recuperação em relação ao grupo de baixa.

A  pressão intracavernosa  (PIC) de cada grupo experimental. Curva preta representa valores de PIC em resposta ao estímulo do nervo cavernoso (CN) estimulação.

Tratamento com LESW melhora angiogênese peniana e recupera a circulação sanguínea no PVNI grupo de ratos. Para determinar se a melhora da função erétil se correlaciona com alterações na vascularização do tecido nas seções dorsais, contamos o número de vasos sanguíneos. No PVNI, a artéria dorsal do pênis entrou em colapso e endotélio ficou significativamente atrofiado (Figuras 2A e 2B). Impressionantemente, desabou artérias penianas dorsais recuperar uma estrutura de aparência normal, com muitos pequenos vasos sanguíneos em torno dele (Figura 2A). Além disso, LESW promoveu a expressão de vWF no tecido peniano em ambos os grupos, de baixa de alta energia (Figuras 2B e 2D). Em linha com melhorias na função erétil, o grupo tratado com LESW apresentava maior regeneração de tecidos. Estes resultados indicam que, embora depois de 5 semanas da lesão pélvica, os ratos controle poderiam regenerar o número de vasos sanguíneos para um nível quase normal, mas a função erétil não foi restaurada nestes animais. Portanto, após a lesão pélvica, o tratamento LESW estimula o aumento da geração de vaso sanguíneo que está fortemente correlacionada com a melhoria da função. Estes estudos indicam que LESW é benéfica na reabilitação tecido cavernoso.

LESW Promove peniana Regeneração Nervosa. Dentro do pênis, a recuperação do nervo dorsal foi examinada com IF coloração de NF. O número de feixes de nervos aumentou significativamente nos grupos tratados com LESW (Figuras 2A e 2C).

O tratamento com LESW promove a regeneração de óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) no nervo cavernoso (CN) do pênis.

A lesão nervosa diminui significativamente as fibras nervosas do  nervo. Após o tratamento com LESW, os números de nervos contendo fibras aumentou (Figura 3B). O aumento da expressão de nNOS nos grupos de tratamento foi confirmada com a Western blot utilizando os lisados de proteína a partir de tecido do pénis (Figuras 3C e 3D). De alta energia tratamento nível LESW pode levar a um aumento da regeneração de fibras nervosas nariz em comparação com os baixos níveis de energia de LESW; no entanto, essas diferenças não foram significativas entre os 2 grupos.

LESW Tratamento Melhora Recrutamento de Edu Células positivas. Como as células progenitoras ou as células estaminais com propriedades são reconhecidos pela sua capacidade para reter timidina EdU analógico por um período prolongado de tempo, nós examinamos o recrutamento de células edu + em animais que receberam uma única injecção EdU birth.22 Um aumento no nível de energia-dependente entre grupos de tratamento (P <0,05) em células edu + nos tecidos cavernosos foi evidente (Figuras 4A e 4B). Usando lisados de tecido do pénis, medimos o nível de expressão de quimiocina estromal derivada fator 1 (SDF-1; As Figuras 4C e 4D), um quimioatractivo clássico para recruitment.26 células progenitoras Após lesão pélvica, maior expressão de SDF-1 correlacionada com o aumento número de células EdU +, e este efeito foi significativamente aumentada por tratamento LESW, especialmente no grupo LESW maior (P <.05).

Efeitos do tratamento LESW sobre as células de Schwann Durante peniana Regeneração Nervosa. As células de Schwann são fundamentais para o crescimento de fibras nervosas e regeneração. Para examinar ainda mais o mecanismo de regeneração do nervo, exploramos o processo de activação das células de Schwann, que é caracterizada por desdiferenciação, rediferenciação, proliferação e maturação. Dois tipos de células de Schwann foram distribuídos em nervos penianos: as células de Schwann mielinizados (MSC) e células de Schwann não mielinizadas (MNMMR). O número de células de Schwann dos nervos dorsais aumentou no grupo LESW em comparação com os outros 3 grupos, ao passo S100 foi altamente expressa tanto em simulada e grupos tratados com LESW mais elevados (Figura 5B). Com base na DAPI resultados, parece que 5 semanas após a lesão pélvica, o número de células (incluindo outras células de Schwann) aumentou para níveis normais espontaneamente (isto é, o grupo PVNI) enquanto que o tratamento LESW aumentou em maior número. Coloração S100 foi aumentada nos grupos de tratamento LESW, sugerindo que LESW pode aumentar a proliferação das células de Schwann. Além disso, nós examinamos 2 marcadores para Schwann desdiferenciação e proliferação celular após a lesão pélvica: p75 e p-ERK1 / 2. Western blot do tecido peniano indicaram que tanto p75 e P-ERK1 / 2 foram significativamente aumentados após terapia LESW.

LESW promove a ativação de células Schwann in vitro. A. Imagem representativa de Western blot para o receptor p75 neurotrofina (p75), Phosphor ERK1 / 2 (p-ERK1 / 2) em células de Schwann 24h (p75) ou 8h (p-ERK1 / 2) após o tratamento LED (SW) ou simulada tratamento (controlo). Análise de transferência de B. ocidental de p-Erk (8h) e p75 (24h). Imagens C. representativos de imunofluorescência para p-ERK1 / 2 (verde) em células de Schwann 8 horas após o tratamento LESW (SW) ou um tratamento simulado (Controle). Ampliação original é × 400. D. representativas de imagem do ciclo celular antes do tratamento (0h) e 8, 16, 24 horas após o tratamento LESW (SW) ou tratamento simulado (controlo). E. percentagem de células em diferentes períodos do ciclo celular. * P <0,05.

 

Discussão

Embora o modelo induzido de Disfunção ErétilI padrão é constantemente utilizado para estudar ED, não há atualmente nenhum bom modelo animal para imitar DE neurovascular. Neste estudo, nós combinamos um modelo de DE no rato que replica estreitamente a lesão pélvica humana durante a cirurgia e trauma. Este modelo lesões combinado prejudicada com sucesso a função erétil para uma longa duração, permitindo estudos de duração prolongada da DE.

Lesão nervosa peniana leva à isquemia, neurodegeneração e capacidade eréctil prejudicada. Tentamos estabelecer uma nova abordagem clínica para corrigir esta condição. Recentemente, o tratamento com ondas de choque de baixa energia (LESW) provou ser uma estratégia terapêutica promissora para DE que foi testado em ensaios clínicos. Os mecanismos dos efeitos terapêuticos e biológicos precisos no tratamento LESW ainda não são completamente compreendidos. Experiências anteriores consideraram que LESW induz neovascularização por regulação positiva da expressão de VEGF e seu receptor e mobilização de células progenitoras. As respostas biológicas da LESW pareceu ser dependente do tempo e de acordo com um relatório anterior, o pico de resposta ocorre 4 semanas após tratamento.

Neste projeto, os ratos nos grupos tratados apresentaram melhora da recuperação funcional e histológica após 4 semanas de tratamento com LESW. Notamos que a angiogênese e recirculação foram promovidos de forma significativa após o tratamento LESW. Os principais componentes nervosos do pênis demonstraram significativamente mais regeneração após o tratamento quando comparados com LESW a regeneração espontânea nos ratos do grupo de controlo não tratado. A regeneração acelerada de fibras nervosas, incluindo fibras nervosas nNOS +, é especialmente emocionante como lesão neural e falta de recuperação do nervo funcional são acreditados para ser o ponto crucial de por que ED neurovascular é refratária à terapia.

O recrutamento de células progenitoras através da rede vascular e tecidos intersticiais é normalmente o primeiro passo da regeneração de tecidos, e é necessário para manutenção dos tecidos para reparo da lesão No entanto, na maioria dos estudos de aplicação exógena de células progenitoras não tem tido muito êxito, por várias razões, incluindo a migração ineficaz para atingir o órgão. Foi sugerido que o recrutamento direto de células progenitoras endógenas para o órgão alvo de interesse pode melhorar o resultado da tratamento células progenitoras. No nosso trabalho utilizou-se presente de retenção de etiqueta com células técnica EdU36, 37 e encontrado mais células progenitoras endógenos em tecido peniano após a lesão pélvica, em consonância com o processo de reparo do tecido. Além disso, encontramos que a terapia LESW levou a um aumento significativo do número de células progenitoras locais em relação aos animais não tratados, de acordo com o nosso relatório anterior, utilizando um modelo ED diabética, 11 e que a expressão de SDF-1, que desempenha um papel principal no recrutamento de células progenitoras, 39 está correlacionada com o número de células edu + no tecido do pênis. LESW pode atuar para aumentar e manter a concentração de SDF-1 na lesão peniana pós tecido, potenciando, assim, prolongar e o recrutamento de células progenitoras endógenas e amplificação in situ na regeneração do tecido. Muitos tipos diferentes de células podem secretar SDF-1, incluindo células endoteliais e células de músculo liso durante lesão ou em resposta à hipóxia, e células progenitoras que expressam CXCR4 poderia ser recrutados por SDF-1 / CXCR4.  Células progenitoras predominantemente contribuem para a regeneração do tecido através de sua habilidade parácrina.  Atualmente não está claro se as células progenitoras em tecidos tratados com LESW são células locais induzidas a se dividir, recrutados de outros sites, ou ambos. Além disso, os efeitos biológicos de qualquer divisão ou o recrutamento de células progenitoras de tecido peniano neste modelo ED permanecem questões abertas.

Nos seres humanos, a regeneração do nervo periférico após uma lesão é conhecido por ser um processo lento, e pode ser um fator subjacente à perda de função do tecido inervado. Portanto, uma avenida potencial para o tratamento de DE seria uma terapia que melhora a cinética da regeneração do nervo após a lesão. Regeneração bem sucedida do nervo periférico é promovida pela activação da célula de Schwann. Após a lesão, pensa-se que algumas células de Schwann se diferenciam em células progenitoras num estado semelhante, proliferam, e, em seguida, repovoam o nervo danificado. Isto é crítico para navegar no crescimento de novas fibras nervosas, especialmente durante a primeira semana ou 2 após a lesão.

Na nossa experiência, a regulação positiva do mediador importante via de sinalização de ERK fosforilada activação (p-Erk) é significativa após o tratamento. ERK / MAPK sinalização é um caminho clássico para indução de proliferation celular e altos níveis de p-Erk também são um gatilho crucial de desdiferenciação de receptores de células de Schwann. Atualmente, a cinética da expressão de p75 após a lesão é desconhecida, mas também descobrimos que a expressão de p75 é regulada positivamente de forma significativa após o tratamento LESW tanto in vitro como in vivo. Juntos, o aumento da expressão destes marcadores indica que tanto induz LESW desdiferenciação e proliferação (também verificada por meio de análise do ciclo celular) das células de Schwann. Embora S100 tem sido amplamente utilizada como um marcador de célula para células de Schwann in vitro, é de notar que a S100 não é um marcador específico. A jusante da desdiferenciação e proliferação, S100 é reconhecido como um gene de maturação e representa a quantidade de células maduras de Schwann. Na nossa experiência, a quantidade de células de Schwann maduras diminuiu após a lesão pélvica devido a degeneração dos nervos. Desdiferenciação e proliferação de células de Schwann distais ao sítio da lesão, juntamente com a activação de ERK / MAPK e resultado p75 em células de Schwann mais maduras e criar e manter um ambiente favorável para o crescimento do nervo por LESW.

 

Conclusão

Tratamento com ondas de choque (LESW) melhora a função erétil em um modelo de rato com lesões neurovasculares pélvicas. Componentes do tecido do pênis, o tecido vascular e especialmente neuronal, demonstrou uma melhor recuperação após esta terapia. O mecanismo destes efeitos benéficos parece ser através do recrutamento de células progenitoras endógenos e ativação das células de Schwann.

 

 

FONTE BIBLIOGRÁFICA

Journal of Sexual Medicine, January 2016Volume 13, Issue 1, Pages 22–32

 

Leia abaixo o comentário deste estudo realizado pelo Dr. Joao Zambon do Departmento de Medicina Regenerativa, Wake Forest University, Winston-Salem, NC, USA, publicado no editorial desta mesma edição do Journal of Sexual Medicine:

 

“Os autores apresentam uma nova aplicação da terapia por ondas de choque em ratos com disfunção erétil (DE). Um modelo de rato de ED foi desenvolvido pelo nervo cavernoso bilateral e lesões pacote pudendas internas. Quarenta e oito horas após a lesão do nervo, os animais foram tratados aleatoriamente com uma onda de choque de baixa energia (0,06 mj / mm2, 300 pulsos a 3 Hz) ou uma onda de choque de alta energia (0,09 mj / mm2, 1.000 pulsos a 3 Hz) . Avaliações funcionais e histológicas após a intervenção mostraram melhoras na pressão intracavernosa, aumento da vascularização e regeneração nervosa.

A terapia por ondas de choque é relativamente nova modalidade terapêutica, minimamente invasiva com comodidade e segurança comprovada. Ele tem sido usado para o tratamento de perturbações músculo-esqueléticas e mais recentemente para diseases.1 isquêmica do coração, 2 Estudos experimentais têm demonstrado que a terapia de ondas de choque induz a regeneração do nervo e estimula angiogenesis.3 Portanto, tem aplicabilidade potencial para o tratamento da disfunção eréctil orgânica.

Na pesquisa científica básica, pequenos modelos animais são úteis para testar diferentes approaches.4 terapêutica Os autores desenvolveram um modelo de rato confiável de ED; no entanto, devido à diferença na anatomia, fisiologia, e as vias de sinalização, é improvável para traduzir mesmos resultados para seres humanos.5 Com isto em mente, eu os encorajo fortemente a realização de mais estudos em animais de grande porte com maior tempo de seguimento e comparar onda de choque A terapia com a terapia padrão-ouro.

Em última análise, felicito os autores para este projecto de investigação demorada. Este artigo descreve uma abordagem interessante que poderia beneficiar muitos pacientes com ED. Mais estudos são necessários para demonstrar a coerência e eficácia do tratamento em grandes modelos animais; no entanto, este estudo representa um importante ponto de partida.”

 

 

 

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